Atividade

104822 - Curso de Verão em Bioquímica e Biologia Molecular - 2022

Período da turma: 10/01/2022 a 21/01/2022

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Descrição: Laboratório de Biologia Molecular do Câncer
Responsável: Daniela Sanchez Basseres
Monitora: Emily Bronze dos Santos

O foco principal do laboratório é desvendar os mecanismos moleculares responsáveis
pela disseminação mestastática visando identificar alvos moleculares para a terapia do
câncer. Uma das características celulares mais importantes para aquisição de capacidade
mestastática é a aquisição e manutenção de um fenótipo tronco-tumoral pelas células
tronco tumorais, que constituem uma subpopulação de células tumorais autorrenováveis
que possuem, não só uma capacidade excepcional de iniciar a formação de tumores,
mas também são responsáveis também pela recidiva após o tratamento e pela
disseminação metastática. Uma das linhas de pesquisa desenvolvidas pelo nosso grupo,
é o estudo das células tronco tumorais presentes nos adenocarcinomas pancreáticos
ductais (PDAC), cuja disseminação metastática é um evento precoce, sendo, portanto, o
PDAC uma doença extremamente letal, com uma sobrevida média de 6 meses e uma
sobrevida global de 5 anos de menos de 7%. Para estudar as células tronco presentes em
PDAC nós utilizamos técnicas para enriquecimento destas células por cultura de
tumoresferas ou expressão de genes reporter em modelos celulares geneticamente
modificados. Para avaliar o perfil molecular, nós usamos abordagens transcritômicas
combinadas com análise de vias e mineiração de dados ou análise da expressão de alvos
específicos. Finalmente, nós utilizamos manipulação genética para inibir ou super-
expressar alvos de interesse e utilizamos ensaios celulares de proliferação e invasão,
bem como ensaios in vivo em modelos animais para avaliar o fenótipo tronco e
metastático. Dentre as técnicas experimentais mais utilizadas pelo grupo destacam-se,
cultura celular, transfecção de células com plasmídeos ou siRNAs, transdução viral,
citometria de fluxo, RNA-Seq, qPCR e Western Blotting, ensaios celulares de
proliferação, morte celular, migração e invasão, bem como ensaios in vivo de formação
de xenotumores ou metástases em camundongos para estudos de progressão tumoral.


Laboratório de Genética Mitocondrial (LGM)
Responsável: Nadja Cristhina de Souza Pinto
Monitora: Victória Vernechio Pereira
Objetivo geral do laboratório:

As mitocôndrias são conhecidas como as produtoras de energia para as
células, com isso há a manutenção da vida eucariótica como conhecemos.
Contudo, as mitocôndrias também participam de outras vias importantes para a
homeostase e tem papéis em diversas patologias. Aqui no LGM nós fazemos
uso de técnicas de bioquímica e biologia molecular para compreendermos
melhor as funções que as mitocôndrias tem nos processos biológicos e no
desenvolvimento de algumas patologias.
Objetivo especifico do meu projeto:
A Doença de Alzheimer (AD) é o principal tipo de demência em idosos e é
caracterizada pela formação das placas amiloides decorrentes do depósito de
peptídeo beta-amiloide (Aβ) no tecido extracelular aos neurônios, e pela
formação de placas neurofibrilares intracelulares. Essas alterações resultam
em morte dos neurônios e diminuição da capacidade cognitiva do paciente,
promovendo a perda de memória e incapacitação. Vários estudos identificaram
diversas modificações na mitocôndria de neurônios de pacientes com AD, mas
a relação causal entre essas alterações e a fisiopatologia da doença ainda é
incerta. Dentre essas alterações, as principais são: desbalanço redox, causado
por uma produção exacerbada de espécies oxidantes; mitofagia deficiente,
principalmente por uma redução de proteínas específicas; aumento de
apoptose e alterações em atividades de reparo de DNA mitocondrial. Nesse
contexto, é fundamental entender como as alterações mitocondriais se
desenvolvem em AD e se contribuem para a morte neuronal. Assim, o objetivo
do meu projeto de mestrado é avaliar o efeito direto do peptídeo Aβ na
integridade da mitocôndria, a partir de um modelo derivado da linhagem de
neuroblastoma humano SH-SY5Y, onde marcadores específicos serão
expressos de forma constitutiva para avaliar a produção de H₂O₂, mitofagia e
apoptose.


Laboratório de Bioquímica e Sinalização Celular
Docente: Deborah Schechtman
Monitor: Allan Pradelli Roldao

A dor é caracterizada pela sensação de desconforto causada através de estímulo
nocivo, gerando uma resposta que pode servir como sinal de alerta ao indivíduo. Nesse
sentido, uma rara síndrome genética traz como consequência para alguns indivíduos a
impossibilidade de sentir dor ou que as mesmas passem desapercebidas. Diante disso,
análises genéticas de uma proteína denominada TrkA nos ajudaram a demonstrar a
ocorrência de mutações distintas nesses pacientes e em regiões diferentes. A importância
da TrkA na via de sinalização da dor já era conhecida pelo fato dela ser composta de um
receptor de fator neurotrófico acoplado a uma tirosina quinase. O fator neurotrófico NGF é
uma proteína secretada por células específicas na região onde ocorreu alguma injúria ou
onde está desencadeado um processo inflamatório. A interação de NGF com a TrkA leva
a uma série de mudanças estruturais que permitem o domínio quinase dessa proteína ser
ativado pelo acoplamento covalente de grupos fosfato (processo denominado fosforilação)
em resíduos de aminoácidos específicos. A presença desses grupos torna possível
interações com outras proteínas presentes na célula que desempenham diversas funções
fisiológicas. Sendo assim, das proteínas que interagem com a TrkA, a PLCg é uma
proteína que ao ser ativada pela quinase, leva a uma posterior ativação de um canal
iônico presente na membrana celular (TRPV1). Uma vez ativado, esse canal permite a
entrada de cátions no interior da célula de neuronio causando uma despolarização - isso
gera um potencial de ação que leva a informação de dor do sistema nervoso periférico
para o sistema nervoso central. Recentemente utilizamos um peptídeo que possui uma
sequencia de aminoácidos idêntica ao trecho da TrkA que interage com a PLCg e
administramos em animais com dor induzida e observamos um grau de analgesia. Isso
nos levou a investigar o papel bioquímico desse peptídeo e nossa hipótese é que ele
compete com a TrkA para interagir com a PLCg e, uma vez que não tem a possibilidade
de catálise, a fosfolipase não é ativada e a sensibilização da dor não ocorre. Nosso foco a
partir daqui é entender como se dá essa interação e obter informações de natureza
cinética e energética, para usar como base para o desenvolvimento de novas moléculas
com fim analgésico. A PLCg liga-se a domínios quinases de outros receptores presentes
nas células e é importante garantir seletividade na ação de novas moléculas. Estamos
investigando justamente a afinidade do domínio de ligação a quinases da PLCg por
diversos receptores para obter pistas das consequências de inibir essa interação e gerar
fenótipos indesejados em outros contextos celulares. Essa investigação é feita por
estudos de dinâmicas computacionais que utilizam modelos matemáticos que levam em
consideração variáveis energéticas das interações. Isso gera um resultado de natureza
preditiva que carece de validação bioquímica in vitro, que será desenvolvido por
experimentos biofísicos como calorimetria por titulação isotérmica, espectroscopias e
anisotropia de fluorescência. Tais técnicas necessitam do domínio de ligação purificado e
do pepídeo sintético. O domínio foi clonado e expresso, e posteriormente purificado para
realização dos ensaios.


Grupo Quimiosfera - NAP Astrobio/USP
Responsável: Prof. Fabio Rodrigues
Monitora: Ana Paula Muche Schiavo

Quando pensamos em vida, as primeiras imagens que vem em nossas mentes são
de animais e plantas. No entanto, a maior parte da vida (tanto em quantidade quanto em
diversidade) que existe em nosso planeta é microscópica. Os microrganismos estão
presentes em todos os lugares da Terra: das geleiras aos vulcões, do mar profundo à
estratosfera, do deserto mais remoto à dentro de nós, sempre encontramos seres
microscópicos onde quer que procuremos. Desde muito cedo na história da Terra, eles
existem e se relacionam intimamente com o próprio planeta, evoluindo junto com os
ambientes em que vivem. Nosso grupo procura entender justamente os aspectos químicos
e bioquímicos da interação da biosfera com a geosfera, a hidrosfera e a atmosfera. O
enfoque principal do Grupo Quimiosfera é no contexto da Astrobiologia, uma área
interdisciplinar da ciência que estuda o fenômeno vida no Universo. A principal abordagem
é o estudo de um subgrupo muito especial da vida: os extremófilos. Extremófilos são seres
vivos, em sua maioria microrganismos, que sobrevivem em condições físico-químicas
ambientais extremas (ex: acidez, altas ou baixas temperaturas, alta concentração de sais,
presença de metais pesados, incidência de radiação, etc). Do ponto de vista da
Astrobiologia, os extremófilos são interessantes porque a maior parte dos ambientes que
conhecemos do Universo são ambientes extremos, assim como a Terra Primitiva (cenário
provável da origem da vida). Entender esses organismos nos ajuda a entender quais os
limites da vida que conhecemos, em quais ambientes extraterrestres ela poderia existir
atualmente ou ter existido no passado, em quais locais a vida poderia surgir e que sinais
poderíamos usar para reconhecer a vida caso existisse em outros corpos planetários. Além
de nos ajudarem a responder perguntas fundamentais da Biologia e Astrobiologia, os
extremófilos têm se mostrado extremamente interessantes para a Biotecnologia. Uma das
abordagens utilizadas por nós é o estudo dos extremófilos isolados de amostras coletadas
em locais extremos, ensaios de sobrevivência a estresses ambientais e posterior
identificação por sequenciamento de DNA. Para a Astrobiologia, são procurados os
chamados Ambientes Análogos (ambientes terrestres que possuam uma ou mais condição
físico-química em comum com um ambiente extraterrestre de interesse). A linha de estudo
explorada pela monitora consiste no estudo em larga escala de microrganismos resistentes a altas concentrações de NaCl e a incidência de radiação UV-C provenientes de ambientes
brasileiros potencialmente análogos a Marte.


Laboratório de Neurociência Molecular
Responsável: Profa.Dra. Bettina Malnic
Monitor: Rafaella Gonçalves Naressi

O olfato é considerado um dos sentidos mais importantes para mamíferos, pelo seu
caráter protetivo na sobrevivência com a percepção de perigos e predadores no
ambiente ao seu redor e também por seus caráteres social e alimentar. Receptores
olfatórios são receptores acoplados à proteína G, formando uma família com mais de
400 genes nos seres humanos e mais de 1000 em camundongos. Cada receptor
olfatório é capaz de discriminar diferentes odorantes de forma combinatorial, levando a
ativação dos neurônios olfatórios e dando início a transdução de sinais em vias
intracelulares. No laboratório, investigamos as bases moleculares envolvidas neste
processo e a distribuição e expressão dos genes destes receptores pelo genoma. Além
dos neurônios olfatórios, os receptores são encontrados em diversos tecidos do corpo
humano, como próstata, coração e outros. Em alguns tipos de células cancerígenas, a
expressão de receptores olfatórios sofre alterações em comparação às células
saudáveis do mesmo tecido. Essa expressão anormal e a ativação destes receptores
pode ativar vias de sinalização não-canônicas, alterando o curso da doença e sendo
até mesmo considerado como possível alvo terapêutico. Neste âmbito, estudamos a
expressão de receptores olfatórios na leucemia mielóide aguda, caracterizada pela
proliferação de progenitores imaturas da linhagem mielóide, mais comum em adultos e
idosos devido a hematopoiese clonal que leva ao acúmulo de mutações na linhagem.
Em nossos experimentos avaliamos a expressão dos receptores olfatórios por análises
bioinformáticas e também por RT-PCR em linhagens celulares comerciais de leucemia
mielóide aguda e pacientes do Instituto Nacional do Câncer (INCA-RJ). Por meio de
ensaios dose-resposta com as linhagens celulares analisamos também os efeitos da
ativação dos receptores olfatórios por odorantes. Entretanto, são poucos os receptores
olfatórios deorfanizados, ou seja, com um odorante estabelecido como responsável por
sua ativação. Portanto, realizamos também a deorfanização dos receptores por meio
de sistema heterólogo.


Laboratório de Estabilidade Genômica
Responsável: Prof. Nicolas Carlos Hoch
Monitora: Victoria Chaves Ribeiro

As informações necessárias para o funcionamento celular estão contidas no genoma
das células. Logo, é de suma importância que os processos que envolvem o material
genético sejam extremamente bem regulados para que este seja preservado. Também
é preciso lembrar que o DNA é uma molécula susceptível à danos e erros. É estimado
na literatura que ocorrem aproximadamente 10 5 danos espontâneos no DNA por célula
por dia. Caso estas lesões não possam ser reparadas, elas podem levar a mutações
ou a morte celular. Para manter a integridade genômica, os organismos
desenvolveram evolutivamente diversos mecanismos, à exemplo das vias de reparo
de DNA, pontos de checagem do ciclo celular e modificações pós-traducionais de
proteínas. Essas modificações pós-traducionais, como ubiquitinação, fosforilação e a
adição de unidades de ADP-ribose, permitem uma rápida sinalização celular,
importantes para diversas atividades celulares, como sinalização à danos no DNA,
degradação de proteínas e morte celular programada.
Nesse contexto, no Laboratório de Estabilidade Genômica estudamos como as células
humanas sinalizam e reparam os diferentes tipos de danos ao DNA e as implicações
de defeitos nessas vias no ser humano, com enfoque na ADP-ribosilação (um tipo de
modificação pós-traducional). Para isso, realizamos o cultivo de células humanas de
linhagem e primárias e utilizamos técnicas como PCR, Western Blotting, microscopia
de fluorescência, ensaio de sobrevivência clonogênica, clonagem, edição genômica
com CRISPR/Cas9 e siRNA.
Recentemente também estamos interessados em entender o papel da ADP-
ribosilação em infecções virais e em um tipo de morte celular programada conhecida
como parthanatos.


Laboratório de Bioluminescência de Fungos (LBF)
Responsável: Prof. Cassius Vinicius Stevani
Monitora: Bianca de Barros Nóbrega

A emissão de luz por cogumelos bioluminescentes foi descrita pela primeira
vez por Aristóteles e permaneceu um mistério durante séculos. O laboratório de
bioluminescência de fungos surge da necessidade de se entender questões
fundamentais sobre o fenômeno, tais como: Qual a função ecológica e
bioquímica da bioluminescência? Quais os genes e as enzimas responsáveis
pela emissão de luz? Quais vias metabólicas estão envolvidas? A emissão de
luz segue ritmo circadiano? Após a identificação de diversos fungos
bioluminescentes brasileiros, o Professor Stevani, seus alunos e colaboradores
começaram a responder muitas dessas questões.
As enzimas responsáveis pela bioluminescência do fungo são HispS, H3H, Luz
e CPH e compõem o Ciclo do Ácido Cafeico. A enzima luciferase (Luz) é
específica para cada organismo, e seu gene pode ser utilizado como gene
repórter intracelular, como ocorre com a GFP (proteína fluorescente verde de
águas-vivas). O estudo da bioluminescência promove o desenvolvimento de
diversas ferramentas analíticas para distintos propósitos, como bioensaios para
monitorar contaminação microbiana, além do uso de genes responsáveis pela
luz como sondas para monitoramento in vivo, permitindo gerar novos
conhecimentos acadêmicos e aplicações acadêmicas, ambientais e clínicas.
Além do estudo da bioluminescência de fungos, em 2020 o grupo iniciou
estudos sobre metagenômica ambiental. O projeto que já coletou e analisou
águas de represas, como a Guarapiranga e de lagoas naturais, visa levantar
informações sobre a biodiversidade de micro-organismos e genes envolvidos
em processos metabólicos em corpos d'água, especialmente no bioma da Mata
Atlântica.
O grupo realiza trabalho de campo e em laboratório. Realiza coleta de
cogumelos na Mata Atlântica, isola o micélio e mantém as culturas em estufas
climatizadas e preservadas em Castellani. Utiliza diversas técnicas para
desvendar as perguntas levantadas como síntese orgânica para preparar
substratos de enzimas, purifica e isola luciferinas, conduz experimentos de
marcação isotópica e cinéticos para elucidar mecanismos de emissão de luz,
técnicas de PCR (reação em cadeia da polimerase), RT-qPCR para avaliar a
expressão gênica, clonagem e expressão de proteínas em bactérias,
desenvolvimento de protoplastos, experimentos circadianos, sequenciamento
por MinION, bem como diversas análises de bioinformática. O trabalho do
grupo é multidisciplinar, entre biologia e química, navegando pela taxonomia,
ecologia, microbiologia, química orgânica, fotoquímica, fotobiologia, bioquímica,
biologia molecular e bioinformática.


Laboratório de Toxinologia Aplicada – Instituto Butantan
Orientadora: Dra Solange Maria Toledo Serrano.
Monitor: Joanderson Pereira Cândido da Silva.

Acidentes ofídicos são considerados um problema de saúde pública a nível global. No
Brasil, a maior parcela de casos é provocada por envenenamentos com serpentes do
gênero Bothrops. Venenos de serpentes desse gênero são compostos por diversas
toxinas que atuam em conjunto para desregular os sistemas homeostáticos dos
organismos de suas presas causando mudanças importantes em nível molecular, celular,
tecidual e do organismo como um todo.
Localizado nas dependências do Instituto Butantan, o Laboratório de Toxinologia
Aplicada – LETA tem como foco a caracterização de venenos e o estudo das respostas
celulares de tecidos e organismos afetados por venenos e toxinas isoladas de diferentes
venenos das serpentes brasileiras. Para o entendimento da complexidade da resposta
desencadeada por estas toxinas são necessárias aplicações de metodologias integrativas,
bem como abordagens experimentais analíticas e computacionais.
As abordagens para estudar os efeitos locais e sistêmicos induzidos por venenos e
toxinas devem considerar a resposta do hospedeiro ao envenenamento, ou seja, a
resposta regulada do organismo ao veneno exibida como mudanças na expressão gênica
e alterações em vias de sinalização. Seguindo essa linha, os estudos do laboratório se
distribuem sob as áreas da imunologia, farmacologia, transcriptômica, proteômica e
análises computacionais, reunindo esforços para esclarecer os mecanismos moleculares
de resposta do hospedeiro a toxinas de aranhas, serpentes e peixes. Integrando o LETA,
na Área de Proteômica Funcional, empregam-se técnicas de química e bioquímica de
proteínas, tais como: espectroscopia, espectrometria de massas, microscopia,
purificação por cromatografia líquida, enzimologia, buscando estabelecer a
caracterização biológica e estrutural de enzimas proteolíticas de venenos de serpentes.
A investigação sobre as atividades de serinoproteinases de venenos de serpentes
(SVSPs, na sigla em inglês) em sistemas biológicos complexos têm permitido avaliar
vários aspectos da severidade dos envenenamentos. PA-BJ (Platelet-Aggregating
proteinase) é uma SVSP isolada do veneno da B. jararaca. Essa proteinase induz
agregação plaquetária por meio da ativação proteolítica dos receptores PAR-1 e PAR-4.
Nesse contexto, o objetivo geral em meu estudo é a caracterização dos efeitos desta
SVSP sobre células endoteliais de pulmão, células musculares lisas vasculares,
fibroblastos e pericitos, para investigar seu papel no envenenamento, em nível tecidual.


Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Departamento de Ciências Biológicas
Laboratório de Desenvolvimento e Crescimento Vegetal
Monitor: Luís Felipe Correa da Silva

Fundado no ano de 2018 pela Prof.ª Dr.ª Nubia Barbosa Eloy, o Laboratório de
Desenvolvimento e Crescimento Vegetal da ESALQ/USP tem como objetivo
compreender como os processos moleculares regulam o desenvolvimento (alterações
morfológicas e fisiológicas que ocorrem no corpo da planta ao longo de sua história de
vida) e o crescimento (aumento irreversível dos órgãos vegetativos da planta) vegetal.
Na maioria dos casos, o tamanho final dos organismos pode ser correlacionado
ao número total de células, bem como o tamanho das mesmas, fazendo com que a
divisão celular seja a principal responsável pelo crescimento vegetal. O progresso do
ciclo celular requer um fino controle espaço-temporal de proteínas regulatórias para a
correta duplicação do DNA, e a consequente distribuição do material genético recém
copiado para as células filhas durante a mitose. Em plantas, assim como em outros
eucariotos, a regulação do ciclo celular depende da atividade de quinases, ou CDK
(cyclin-dependent kinases). A atividade das CDKs, a qual é crucial em ambas as fases
de transição do ciclo celular (G1-S e G2-M), é regulada por meio da associação com
subunidades regulatórias, chamadas de ciclinas, através de fosforilação, defosforilação,
interação com proteínas inibitórias e proteólise. A proteólise de proteínas regulatórias
do ciclo celular ocorre por meio da via mediada por ubiquitina, a qual garante a
irreversibilidade do processo. A especificidade da proteólise é obtida ao nível da enzima
E3 ligase, que marca o substrato para ubiquitinação. As E3 ligases têm papéis chaves
em diversos processos, especialmente no ciclo celular. As duas principais E3 ubiquitina
ligases envolvidas no ciclo celular são: Skp1-cullin-Fbox (SCF), e o Complexo
Promotor da Anáfase/Ciclossomo (APC/C).
Atualmente, os projetos desenvolvidos no laboratório visam compreender o
papel do ciclo celular no metabolismo vegetal por meio do estudo do papel
desempenhado pelo APC/C neste processo. Para isso, são realizadas análises fenotípicas de plantas de Arabidopsis thaliana, em que os níveis de expressão de cada uma das
subunidades do APC/C estão alterados.
Dentre as técnicas mais utilizadas diariamente, temos: PCR, qPCR, eletroforese
em gel de agarose, clonagem, extração de RNA e DNA, transformação bacteriana,
cultivo de células bacterianas, transformação de plantas, cultivo de plantas transgênicas
em casa de vegetação certificada e in vitro, cruzamento entre linhagens de plantas e
diferentes análise fenotípicas, como área foliar, tamanho total da planta e tamanho da
raiz.

Carga Horária:

80 horas
Tipo: Optativa
Vagas oferecidas: 200
 
Ministrantes: Carlos Takeshi Hotta
Guilherme Andrade Marson
Nicolas Carlos Hoch


 
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