Atividade

94683 - Conhecimento de Técnicas Utilizadas nos Estudos Epidemiológicos de Bactérias de Interesse Clínico

Período da turma: 02/03/2020 a 31/08/2020

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Descrição: INTRODUÇÃO
A epidemiologia bacteriana, alguns anos atrás, era estudada praticamente levando-se em conta características fenotípicas clássicas tais como biotipo, sorotipo, fagotipo, padrão de suscetibilidade a antimicrobianos, entre outros. Essas técnicas de tipagem acima citadas são muito úteis e fornecem importantes informações e por essa razão são ainda muito utilizadas. Entretanto, esses métodos convencionais são muitas vezes limitados por sua baixa capacidade de diferenciação de subtipos dentro de uma determinada espécie e problemas referentes a reprodutibilidade (Olive e Bean, 1999).
Atualmente, muitos métodos genotípicos são utilizados na identificação, caracterização e em estudos epidemiológicos e taxonômicos bacterianos com grande sucesso. Tais estudos de investigação epidemiológica molecular possibilitam determinar a fonte e os veículos de transmissão, bem como, informam se os microrganismos envolvidos nos surtos representam ou não um único clone. A premissa básica de todos esses métodos reside no fato que amostras bacterianas relacionadas epidemiologicamente apresentam um precursor comum (Olive e Bean, 1999; Van Belkum et al., 2001).
Métodos moleculares são utilizados tanto na tipagem como em estudos epidemiológicos de bactérias de interesse clínico. Dentre as bactérias de interesse clínico nosso laboratório tem especial interesse em estudar bactérias do gênero Salmonella. Campylobacter, Shigella e Yersinia. Para a tipagem molecular e estudos epidemiológicos de Salmonella spp., Campylobacter spp., Shigella spp., Yersinia spp., as metodologias de ERIC-PCR, Pulsed-field gel electrophoresis, sequenciamento de genes, entre outras, vêm sendo utilizadas com sucesso (Fredriksson-Ahomaa et al. 1999; Wojciech et al. 2004; Falcão et al. 2006; Romani et al., 2007; Rivoal et al. 2008; Souza et al. 2010; Campioni et al. 2012; Campioni & Falcao 2014; Almeida et al. 2013; Almeida et al. 2015; Gomes et al., 2016).

OBJETIVOS
Os objetivos desse Programa de Atualização são proporcionar ao candidato(a) a prática e o conhecimento teórico de algumas das técnicas utilizadas nos estudos epidemiológicos de bactérias de interesse clínico.

MATERIAL E MÉTODOS
1-Amostras Bacterianas
Nesse Programa de Atualização trabalharemos com bactérias de interesse clínico a serem escolhidas entre os gêneros Salmonella, Campylobacter, Yersinia e Shigella. As amostras bacterianas fazem parte da coleção do nosso laboratório na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP.
2- Pesquisa dos genes de virulência por PCR
O DNA genômico será extraído segundo descrito por Campioni & Falcao (2014) e suas concentrações determinadas segundo Sambrook e Russel (2001). De maneira geral, o procedimento para PCR será feito de acordo com a metodologia de Saiki et al.(1998). Os primers e os parâmetros (Desnaturação, Pareamento, Extensão) para os ciclos de amplificação serão padronizados, seguindo-se como padrão inicial as condições especificadas para o gene inv como descrito por Rasmussen et al. (1994), para o gene ail segundo Nakajima et al. (1992), do gene ystA como descrito por Ibrahim et al. (1997), do gene ystB segundo Ramamurthy et al. (1997) e do gene virF como descrito por Wren e Tabaqchali (1990), genes de virulência de Y. enterocolitica. Os produtos de amplificação de PCR serão submetidos a eletroforese em gel de agarose, corados com brometo de etídeo (0.5 μg/mL), visualizados por luz U.V. e registrados com o software fotográfico. Alternativamente, poderão ser estudados os genes de virulência de Salmonella, Campylobacter ou Shigella.
3-Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)
As amostras serão cultivadas em BHI a 25oC sob agitação por 12-18hs e reinoculadas em LB até atingirem D.O. entre 0.6 e 0.9. O DNA genômico será preparado em blocos de gel de agarose segundo protocolo de Falcão et al. (2006). Esse preparo envolve a inclusão das células bacterianas em blocos de gel de agarose. O DNA preparado dessa forma será digerido com XbaI por 12-16 horas e os fragmentos serão resolvidos por PFGE. As condições da corrida serão realizadas segundo segundo instruções dos manuais disponíveis no Pulse Net USA (Pulsenet 2004) para Salmonella spp (Ribot et al. ,2006) e Campylobacter spp. (Ribot et al., 2001) . Após a corrida, os géis serão corados com brometo de etídeo (0.5 μg/mL), visualizados por luz U.V. e registrados com o software fotográfico. A análise dos dados será feitacoonforme descrito por Souza et al. (2010) e/ou Campioni et al. (2012), utilizando-se o programa Bionumerics 7.0 (AppliedMaths, Keistraat, Belgium).
4- Sequenciamento do flaA
Será realizado para linhagens de Campylobacter spp seguindo as condições descritas por Meinersmann et al. (1997).
Os amplicons obtidos serão purificados utilizando o Kit de purificação Pure LinkTM Quick PCR Purification Kit (Invitrogen - Life Technologies), para posteriormente, serem sequenciados. Para o sequenciamento do gene de cada linhagem, serão realizadas pelo menos quatro reações de amplificação, duas em sentido forward e duas em sentido reverse, para garantir a reprodutibilidade e qualidade das sequências obtidas. O sequenciamento será realizado no Laboratório de Genética Molecular, localizado na Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto, em sequenciador automático de DNA ABI 3500xL (Applied Biosystems - Life Technologies).
4.1- Análise dos dados e construção do dendrograma de similaridade genética
A sequência do gene de uma mesma linhagem será analisada pelo programa ChromasPro versão 1.41 (Technelysium PtY LTD). Pela análise dos eletroferogramas serão gerados contigs a fim de se obter a sequência consenso para o gene de cada linhagem sequenciada.
A análise dos dados será realizada utilizando-se o programa Bionumerics 7.0 (AppliedMaths, Keistraat, Belgium). O dendrograma de similaridade genética será construído analisando a sequência para cada linhagem com o método de UPGMA e modelo de substituição de distância de Kimura de 2-parâmetros, com valor de bootstrap 1000, conforme descrito por Souza et al. (2010). Ademais será feita a análise comparando as linhagens do presente estudo com linhagens disponíveis no banco de dados online: http://pubmlst.org/campylobacter/flaA/.

CRONOGRAMA DE EXECUCÃO DAS ATIVIDADES
1-Lavagem e esterelização de vidrarias;
2-Preparo de reagentes e meios de cultura para a execução das metodologias;
3-Pesquisa de genes de virulência por PCR;
4-Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE);
5-Sequenciamento;
6-Revisão da literatura referente a cada uma das metodologias que serão realizadas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
-Almeida, F. , Medeiros, M. I. C., Rodrigues, D. P., Falcao, J. P. Genotypic diversity, pathogenic potential and the resistance profile of Salmonella Typhimurium strains isolated from humans and food from 1983-2013 in Brazil. Journal of Medical Microbiology, v. 64, p. 1395-1407, 2015
-Almeida, F., Pitondo-Silva, A., Oliveira, M. A., Falcao, J. P. Molecular epidemiology and virulence markers of Salmonella Infantis isolated over 25 years in São Paulo State, Brazil. Infection, Genetics and Evolution, v. 19, p.145-151, 2013.
-Campioni, F.; Bergamini, A.M.M.; Falcao, J.P. Genetic diversity, virulence genes and microbial resistance of Salmonella Enteritidis isolated from food and humans over a 24-year period in Brazil. Food Microbiology 32, 254-264, 2012.
-Campioni, F., Falcão, J. P. Genotypic diversity and virulence markers of Yersinia enterocolitica biotype 1A strains isolated from clinical and non-clinical origins. APMIS. Acta Pathologica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica, v. 122, p. 215-222, 2014
-Falcão, J.P.; Falcão, D. P.; Pitondo-Silva, A.; Malaspina, A. C.; Brocchi, M. Molecular typing and virulence markers of Yersinia enterocolitica strains from human, animal and food origins isolated between 1968 and 2000 in Brazil. J. Med. Microbiol., v. 55, p. 1539-1548, 2006.
-Fredriksson-Ahomaa, M.; Autio, T.; Korkeala, H. Efficient subtyping of Yersinia enterocolitica bioserotype 4/O:3 with pulsed-field gel eletrophoresis. Lett. Appl. Microbiol., v. 29, p. 308-312, 1999.
-Ibrahim, A.; Liesack, W.; Griffiths, M.W.; Robins-Browne, R.M. Development of a highly specific assay for rapid identification of pathogenic strains of Yersinia enterocolitica based on PCR amplification of Yersinia heat-stable enterotoxin gene (yst). J. Clin Microbiol., v. 35, p. 1636-1638, 1997.
-Meinersmann, R.J.; Helsel, L.O.; Fields, P.I.; Hiett, K.L. Discrimination of Campylobacter jejuni isolates by flaA gene sequencing. Journal Clinical Microbiology, n.35, p.2810-2814, 1997.
-Nakajima, H.; Inoue, M.; Mori, T.; Itoh, K-I.; Arakawa, A.E.; Watanabe, H. Detection and identification of Yersinia pseudotuberculosis and pathogenic Yersinia enterocolitica by an improved polymerase chain reaction method. J. Clin. Microbiol., v. 30, p. 2484-2486, 1992.
-Gomes, C. N., Souza, R. A. , Passaglia, J. , Duque, S. S., Medeiros, M. I.C. , FALCAO, J. P. Genotyping of Campylobacter coli strains isolated in Brazil suggests possible contamination amongst environmental, human, animal and food sources. Journal of Medical Microbiology, v. 65, p. 80-90, 2016.
-Olive, D.M.; Bean, P. Principles and applications of methods for DNA-Based typing of microbial organisms. J. Clin. Microbiol., v. 37, n.6, p. 1661-1669, 1999.
-Pulse Net USA CDC. The national molecular subtyping network for foodborne disease surveillance at http:// www.cdc.gov/pulse-net/, p. 1-13, june 2004.
-Rasmussen, H.N.; Rasmussen, O.F.; Andersen, J.K.; Olsen, J.E. Specific detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by two-step PCR using hot-start and DMSO. Mol. Cel. Probes., v. 8, p. 99-108, 1994.
-Ramamurthy, T.; Yoshino, K-i.; Huang, X.; Nair, G.B.; Carniel, E.; Maruyama, T.; Fukushima, H.; Takeda, T. The novel heat-stable enterotoxin subtype gene (ystB) of Yersinia enterocolitica: nucleotide sequence and distribution of the yst genes. Microbiol. Pathogen. v. 23, p. 189-200, 1997.
-Ribot, E. M.; Fitzgerald, C.; Kubota, K.; Swaminathan, B.; Barrett, T. J. Rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for subtyping of Campylobacter jejuni. Journal Clinical Microbiology, n.39 , p. 1889 -1894, 2001.
-Ribot, E.M.; Fair, M.A.; Gautom, R.; Cameron, D.N.; Hunter, S.B.; Swaminathan, B.; Barrett, T.J. Standardization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for the subtyping of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella for PulseNet. Foodborne Pathogens and Disease, v. 3 (1), p. 59 – 67, 2006.
-Rivoal, K.; Protais, J.; Quéguiner, S.; Boscher, E.; Chidaine, B.; Rose, V.; Gautier, M.; Baron, F.; Grosset, N.; Ermel, G.; Salvat, G. Use of pulsed-field gel electrophoresis to characterize the heterogeneity and clonality of Salmonella serotype Enteritidis, Typhimurium and Infantis isolates obtained from whole liquid eggs. Int. J. Food Microb., v.129, p.180-186, 2009.
-Romani, C., Nicoletti, P., Buonomini, M.I., Nastasi, A., Mammina, C. Reinterpreting a community outbreak of Salmonella enterica serotype Enteritidis in the light of molecular typing. BMC Public Health, v. 7: 237, p. 1-6, 2007.
-Saiki, R.K.; Gelfand, D.H.; Stoffel, S.; Scharf, S.J.; Higuchi, R.; Horn, G.T.; Mullis, K.B.; Erlich, H.A. Primer-directed enzimatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, v. 239, p. 487-491, 1988.
-Sambrook, J., Russuel, W. D., Molecular Cloning: a laboratory manual. 3th ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.
-Souza, R.A.; Pitondo-Silva, A., Falcão, D.P., Falcão, J.P. Evaluation of four molecular typing methodologies as tools for determining taxonomy relations and for identifying species among Yersinia isolates. Journal of Microbiological Methods, v. 82, p. 141-150, 2010.
-Van Belkum, A.; Struelens, M.; De Visser, A.; Verbrugh, H.; Tibayrenc, M. Role of genomic typing in taxonomy, evolutionary genetics, and microbial epidemiology. Clin. Microbiol. Rev., v. 14, n. 3, p. 547-560, 2001.
-Wojciech, L., Staroniewicz Z., Jakubczak A., Ugorski M. Typing of Yersinia enterocolitica isolates by ITS profiling, REP- and ERIC-PCR. J. Vet. Med. 51 238-244, 2004.
-Wren, B.W.; Tabaqchali, S. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by the polymerase chain reaction. Lancet, v.336, p. 693, 1990.

Carga Horária:

306 horas
Tipo: Obrigatória
Vagas oferecidas: 1
 
Ministrantes: Juliana Pfrimer Falcão


 
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