Dar aos alunos instrumentos para entender as práticas e estratégias de clonagem mais comuns em âmbito vegetal, de maneira de capacita-los a efetuar clonagens moleculares de genes de seu interesse. Detalhar aos alunos as diferentes estratégias de clonagem, focando na clonagem em função da pergunta biológica do aluno. Efetuar aulas práticas no laboratório para os alunos se familiarizarem com os principais instrumentos e métodos de um laboratório de Biologia Molecular.
Recapitulação de conceitos básicos de DNA, RNA, Proteínas e Promotores e Genes Reguladores. Introdução a clonagem gênica - a pergunta biológica em primeiro lugar. A importância dos controles nos experimentos. Fluxo de trabalho da clonagem até transformação de plantas. Principios básicos de extração de DNA e RNA. Métodos de validação da qualidade de DNA e RNA. Visualização do rRNA em Gel de Agarose, quantificação e qualificação do mRNA via Nanodrop e Bioanalyzer. Métodos de amplificação por PCR. Clonagem de mRNA de genes não sequenciados - 3’ e 5’ RACE. Caracterização de diferentes polimerases. Enzimas de restrição. Enzimas exonucleasicas. Metodologias clássicas de clonagem por enzimas de restrição e sistemas por recombinação Cre/Lox e Gateway. Multicloning sites com Gateway. Transformação de E.coli e A. tumefaciens. Vetores de clonagem - análise de elementos principais. Vetores de transformação em plantas - análise de elementos fundamentais e variáveis. Seleções antibióticas e fluorescentes. Vetores de super-expressão, de silenciamento, de edição genômica e enhancer trap lines. Genes reporter - GFP, GUS e Luc. - diferenças e vantágens na análise dos promotores. Métodos de transformação de plantas via biolística e Agrobacterium. Seleção de transformantes. Confirmação de inserção via PCR e Southern Blot.
Histórico e conceitos de clonagem gênica. Noções sobre elementos presentes em plasmídeos de clonagem e de transformação, elementos necessários para a transferência gênica de sistemas bacterianos a vegetais mediados por Agrobacterium. Noções de estratégias de clonagem gênica via enzimas de restrição e via recombinação (sistemas Cre/Lox e Gateway).
Literatura Básica: Alberts, B.; Bray, D.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. Biologia Molecular da Célula. 5a Edição brasileira. Artmed, Porto Alegre. T.A.Brown . Genomas. 3a edição, Ed. brasileira Médica Panamericana. 2007. Lewin, B.; Krebs, J.; Kilpatrick S.T. & Goldstein E.S.. Gene XI. Jones & Bartlett Press. 2014. Ana Cristina Miranda Brasileiro & Vera Tavares de Campos Carneiro. Manual de Transformação Genética de Plantas, 2ª Edição. 2015. Editora EMBRAPA. T. A. Brown. Clonagem Gênica e Analise de DNA: Uma Introdução. 2003. Artmed Editora. Literatura Complementar: T.A. Brown. Gene Cloning and DNA Analisys: An Introduction. 7th Edition. 2015 Wiley Blackwell Editors. Periódicos com assunto relacionado às Ciencias Biológicas: M.R. Green & R. Sambrok. Molecular Cloning: A laboratory Manual, 4th Edition. 2013. CSHL Press.
